lunes, 19 de julio de 2010

HEMOCULTIVO

El hemocultivo:

Una investigación clave para el diagnóstico de las infecciones en sangre.


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Lic. Alberto Calvo F.

Bacteriólogo Policlínica Metropolitana – Caracas

Asesor Científico Microbiología. Ganbaro

El concepto de sepsis involucre en la actualidad una serie de parámetros clínicos y de laboratorio que incluyen en primer lugar, la sospecha de infección clínicamente documentada, o confirmada microbiológicamente con el aislamiento del microorganismo en sangre, mas la presencia de al menos dos de los siguientes criterios: fiebre (> 38°C) o hipotermia (< style=""> o pacientes en ventilación mecánica y finalmente parámetros hematológicos como leucocitosis (mayor de 12.000), presencia de cayados en el frotis de sangre periférica o una leucopenia menor a las 4.000 celulas. De manera sencilla también puede ser definido como un síndrome clínico complejo resultado de la respuesta inflamatoria y sistémica del paciente a la infección. Corresponde a la causa subyacente mas frecuente de muerte en las unidades de cuidado intensivo no coronarias, en las que la tasa de mortalidad puede oscilar entre un 32 a 54% en los casos de sepsis grave o shock séptico respectivamente. Datos recientes sugieren que la principal fuente de origen de sepsis está representada por las infecciones del tracto respiratorio y gastrointestinal (32%), seguido por el tracto urinario (30%) y pierl y partes blandas (5%).

El diagnóstico precoz es uno de los factores mas decisivos en la evolución del paciente, siendo el hemocultivo la herramienta diagnóstica que permite al laboratorio establecer la etiología y realizar al microorganismo aislado las pruebas de sensibilidad a los antibióticos con la finalidad de establecer las opciones terapéuticas de manera dirigida. Dependiendo de la severidad del proceso el 30-50% de los hemocultivos en este grupo de pacientes será positivo. Para que este resultado tenga relevancia clínica es necesario cumplir con las recomendadiones establecidad para la realización del mismo al momento de la toma de la muestra en cuanto a la descontaminación del sitio de la punción, volumen de sangre a tomar, numero de frascos a inocular y sets de hemocultivos a ser tomados por paciente. Igualmente es importante el método utilizado en el laboratorio para realizar el hemocultivo, para lo cual el microbiólogo debe evaluar parámetros como el numero de hemocultivos procesados por año, tipo de población atendida y recursos económicos del centro hospitalario, entre otros, al momentos de escoger el sistema que mejor se adapte a sus necesidades y posibilidades con la mayor calidad posible.

En la actualidad se encuentran disponibles sistemas automatizados para el monitoreo de los hemocultivos los cuales detectan por colorimetría el dióxido de carbono liberado durante el crecimiento microbiano en los medios de cultivo. Entre los mas utilizados se encuentran BacT/Alert (bioMerieux), Bactecn (Becton Dickinson) y VersaTrek (Trek Diagnostic). Comparaciones realizadas entre los sistemas muestran resultados similares entre ellos, sin embargo en el caso especifico de BacT/Alert se ha encontrado una mejor detección en el caso del retardo en la introducción de las botellas en el instrumento (posterior a las 24hrs de tomada la muestra) debido a la incorporación de tres algoritmos para la detección de positividad, dentro de los cuales se incluye la posibilidad de detección de niveles basales altos de dióxido de carbono. Estos sistemas representan una valiosa herramienta para el procesamiento de los hemocultivos evitando el chequeo visual de las botellas buscando signos de positividad asi como el repique diario de los mismos. Adicional a las ventajas que desde el punto de vista de procesamiento de las muestras representan los sistemas automatizados esta la detección precoz de positividad, la cual representa la mayor ventaja desde el punto de vista clínico. Datos publicados por Bourbeau y cols señalan que el 74% de los hemocultivos positivos son detectados en las primeras 24 horas mientras que el 94% lo son en las 48 horas de monitoreo en los sistemas automatizados. Otro punto importante es la reducción en el tiempo de incubación de las botellas para descartar las mismas como negativas, está demostrado que actualmente protocolos de 5 días de incubación son suficientes, incluso en los casos de endocarditis, para la detección del agente causal, incluyendo gérmenes de crecimiento lento como Brucella, Capnocytophaga, Campylobacter y miembros del grupo HACEK.

Otra metodología disponible es la técnica de lisis centrifugación o Isolator, la cual permite la cuantificación de la carga bacteriana y el mejora el aislamiento de germenes intracelulares, representando el método ideal para el aislamiento de micobacterias y hongos filamentosos, por lo cual se recomienda como método alternativo cuando se sospeche de esta etiología o en el caso de que la población mayormente atendida por el laboratorio sean pacientes inmunosuprimidos, donde la prevalencia de estos microorganismos es alta.

Otra de las variantes que debe ser considerada es el momento de la toma de muestra la cual de ser posible debe preceder a la aparición de todos los síntomas, específicamente en el momento de los escalofríos y preferiblemente antes del comienzo de la terapia antimicrobiana. En caso de que el paciente este recibiendo antibióticos, la toma de la muestra debe realizarse justo antes de la aplicación de la siguiente dosis con el fin de garantizar que se encuentre en el nivel valle de la droga y la utilización de botellas especiales, disponibles en los sistemas automatizados, que tienen en su composición compuestos tales como carbón activo y resinas que permiten la absorción del antibiótico y una mejor recuperación del microorganismo al momento de tomar los hemocultivos. En el caso especifico de BacT/Alert (bioMerieux) las botellas FAN además de poseer carbón activo para la absorción del antibiótico, posee compuestos que van a inhibir mecanismos de defensa del huésped como la fijación del complemento, opsonizacion y fagocitosis, con lo cual la recuperación sera mucho mayor que con los métodos tradicionales.

Es importante también el numero de muestras a tomar, asi como el numero de botellas por set. Debido a que la mayoría de las bacteriemias y/o fungemias son intermitentes todas las guias recomiendan actualmente la toma de dos o tres sets de hemocultivos por paciente de sitios anatomicos diferentes dentro del intervalo de una hora, asi como la toma de dos botellas por cada set para aumentar la posibilidad de recuperación del patógeno involucrado. Este protocolo de toma de muestra ayudará también al momento de adjudicarle importancia clínica a un germen considerado clásicamente contaminantes, como por ejemplo estafilococos coagulasa negativa o estreptococos del grupo viridans, los cuales en caso de ser contaminantes de piel generalmente serán aislados en una sola botella o en un solo set de hemocultivos, a diferencia de los casos en los cuales revistan importancia clínica donde normalmente serán aislados en mas de una pareja. La necesidad de tomar dos botellas por set de hemocultivo (combinación aerobica-anaerobica o dos aerobicas en caso de baja prevalencia de bacteriemias por anaerobios) quedo demostrada en un estudio publicado en el 2007 por Weinstein y cols en el cual se investigo la sensibilidad acumulada de los hemocultivos obtenida de forma secuencial en un periodo de 24hrs utilizando sistemas automatizados de monitoreo continuo, encontrando que el rendimiento acumulado de patógenos de tres tomas de hemocultivos (2frascos por toma) con un volumen de sangre de 20ml por pareja (10ml por frasco) fue de 73,2% con la primera pareja, 93.9% con las dos primeras parejas y 96,9% con las tres parejas. En cuanto a la utilización o no de la botella anaeróbica de rutina dependerá de la especialidad de hospital (ejm: alta rotación de pacientes con cirugía abdominal) y de la prevalencia de infecciones por anaerobios del mismo (si esta documentada), en cualquier caso la incorporación de la botella anaeróbica en la mayoría de los casos permite la detección mas precoz de positividad en los casos de gérmenes aerobios facultativos.

Igualmente es critico el volumen de sangre a tomar por hemocultivo. En los adultos los cultivos cuantitativos han demostrado que la carga bacteriana durante la bacteriemia es muy baja, a menudo menor de 10ufc/ml, lo cual explica el porque ha mayor volumen de sangre inoculada en las botellas la posibilidad de recuperación del agente etiológico aumentará. Es importante ene ste sentido recalcar que debe mantenerse una relación entre el volumen de sangre y el volumen del medio de cultivo utilizado, siendo recomendad la relación 1:10 como factor de dilución, con un volumen minimo de 10 ml por botella en adultos. En el caso de los niños la carga bacteriana es mayor, por lo cual el volumen de sangre a ser inoculada puede ser menor, recomendando siempre la utilización de una botella aerobica. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que cerca del 68% de las bacteriemias en niños menores de 2 meses cursan con contajes menores a 10 ufc/ml, es por ello, que en el caso especifico de los niños, el volumen de la muestra a tomar dependerá del peso del paciente. En menores de 1kg el volumen de sangre recomendado es de 2ml en una sola botella, mientras que en los niños de 1 a 2kg se recomienda la toma de dos sets de hemocultivos de 2 ml de sangre de cada uno, finalmente, en el caso de niños con peso entre los 2 y 12,7kg, el protocolo recomendado es la realización de 2 hemocultivos, el primero con 4cc de sangre y el segundo con 2cc. En ninguno de los casos el volumen de muestra tomado excederá el 4% del volumen total de sangre del paciente.

En conclusión, el hemocultivo es la principal herramienta para documentar de forma confiable el diagnostico de bacteriemia y/o septicemia en el laboratorio y como se ha visto su resultado esta afectado por una serie de variables preanaliticas que deben ser tomadas en cuenta al momento de la toma de la muestra. Representa un procedimiento sencillo y seguro si se siguen las normas establecidas en los protocolos descritos y es responsabilidad del microbiólogo que las mismas sean cumplidas de manera adecuada y efectiva en beneficio del paciente. Los sistemas automatizados de monitoreo continuo representan una excelente herramienta para los centros con alto volumen de recepción de muestras, simplificando el procesamiento de los mismos además de permitir un diagnostico precoz, con las consecuentes ventajas que desde el punto vista clínico, terapéutico y económico esto conlleva.

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Tomado de: Revista Bioanálisis Vol.22. N° 1. 2009; 28-29.

domingo, 18 de julio de 2010

Anticuerpos Anti-Péptido Citrulinado Cíclico


Anticuerpos Anti-Péptido Citrulinado Cíclico

Verónica Mezzano R., Sergio Iacobelli G.

Depto. de Inmunología Clínica y Reumatología,

Hospital Clínico, Pontificia Universidad Católica de Chile

Summary

The determination of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies (anti-CCP) is an extremely useful laboratory test in the differential diagnosis of patients in which Rheumatoid Arthritis (RA) is suspected. Citrullination is an unspecific protein modification associated to inflammation. The production of antibodies directed against citrullinated antigens in the synovial membrane is, on the contrary, specific for RA, for which important associations between these and the pathogen of the disease have been described. This review focuses on the different characteristics that make this test routinely asked for in clinical practice: high specificity; high positive predictive value in undifferentiated arthritis; early manifestation, development prior to clinical disease, and its association with a more aggressive course of the disease.

Key words: anti-CCP, rheumatoid arthritis.

INTRODUCCION

Actualmente el uso del laboratorio constituye un pilar indispensable en el diagnóstico y tratamiento de las enfer­medades reumatológicas. Existe una búsqueda permanente de marcadores sensibles, específicos, de aparición precoz y ojalá con capacidad pronóstica. Esto es especialmente importante en la Artritis Reumatoide (AR), en la que se han producido avances significativos en el tratamiento, con mejores resultados dependiendo de la precocidad del diagnóstico. El descubrimiento de los anticuerpos anti­péptido citrulinado cíclico o anti-CCP ha marcado un gran avance en este sentido. Éstos son, a la fecha, los anticuerpos más específicos identificados para AR(1) y la precocidad de su aparición en los enfermos hace hoy en día su uso casi rutinario.

Relación con la Patogenia de la Artritis Reumatoide

La citrulina es un aminoácido ubicuo no tradicional que no se incorpora a las proteínas durante la traducción. La citrulinación constituye un cambio postraduccional producido por la peptidilarginina deaminasa (PAD) sobre residuos de arginina. Los anticuerpos antiproteínas citru­linadas fueron inicialmente descritos como antifactor perinuclear (APF) y posteriormente como anticuerpos antiqueratina (AKA) y anti-filagrina (AFA),(2) hasta la identificación del antígeno común, la citrulina. Las pro­teínas que se han identificado como blancos citrulinados para los anticuerpos son diversas, entre las cuales la prin­cipal es la filagrina, incluyéndose también la vimentina y fibrina.

La citrulinación no es un evento específico de la mem­brana sinovial, sino que se puede ver en diversos tejidos asociada a inflamación, como en músculos de pacientes con polimiositis, tejido colónico en pacientes con enfermeda­des inflamatorias intestinales y amígdalas en pacientes con tonsilitis crónica.(3) En cambio, es específica la respuesta humoral a la citrulinación, con producción de autoanti­cuerpos sólo en AR. Estos anticuerpos serían producidos localmente por células plasmáticas contra proteínas citruli­nadas de la sinovial inflamada. Estos anticuerpos se pueden encontrar tanto en líquido sinovial como en la sangre; los valores en ambos fluidos se correlacionarían.(4, 5)

Se le ha atribuido a la citrulinación un papel patogé­nico, vinculándola al epítope compartido del HLA. En la presentación antigénica a las células T la presencia de alelos HLA-DRB1 *0401 confiere especial susceptibili­dad para el desarrollo de la AR. Si bien no se ha identifi­cado con precisión un antígeno gatillante de la respuesta inmune correspondiente, el grupo de aminoácidos que conforman el epítope compartido forman un bolsillo, P4, en el cual el encaje de la citrulina sería específico y man­tenido por la neutralidad de la molécula, en comparación con la carga positiva de la arginina.(6, 7)

Recientemente también se han descrito una asocia­ción entre isoformas de la PAD, específicamente PAD4, y la propensión al desarrollo de la AR en algunas pobla­ciones.(8, 9)

Se ha descrito también una mayor susceptibilidad para el desarrollo de anticuerpos anti-CCP en individuos portadores de alelos del epítope compartido HLA-DRB1 gatillado por el estímulo ambiental del tabaquismo. Esta asociación tabaco-desarrollo de anti-CCP no se evidenció en pacientes no portadores de epítope compartido. Estas observaciones sugieren caminos patogénicos distintos en la AR con y sin anti-CCP. Éste es un tema aún en discu­sión, ya que la relación genético-ambiental descrita se ha demostrado en pacientes suecos,(10) no confirmándose en estudios de pacientes norteamericanos.(11)

CAracterísticas de laboratorio

Para el uso clínico de los anticuerpos anti-CCP se desarrolló un péptido sintético de forma cíclica que con­tiene numerosos residuos de citrulina que son expuestos de tal manera que facilita su detección por los anticuerpos.

La técnica usada para la búsqueda de anti-CCP es el ELISA, cuyos kits de uso comercial están ampliamente disponibles. Desde su descubrimiento, la calidad de estos kits ha ido mejorando en cuanto a sensibilidad y especifi­cidad, por lo que en la literatura aparecen descritos como de primera, segunda o tercera generación (CCP1, CCP2 y CCP3, respectivamente). Desde su desarrollo en 2002 se usan los de segunda generación principalmente.

Los resultados se expresan en unidades/mililitro (U/mL), y los valores de corte dependen del kit usado. En aquellos de mayor uso en nuestro país, se considera positivo sobre 25 U/mL y definitivamente positivo sobre 50 U/mL, por lo que el rango entre 25 y 50 U/mL debe ser interpretado por el médico en el contexto clínico del paciente.

Si bien la detección automatizada hace fácil y confia­ble su detección, éste sigue siendo un examen caro.

Características clínicas

Para el análisis de las ventajas del uso de anti-CCP se separará el análisis según las distintas caraterísticas que han sido descritas desde su aparición. La mayor parte de éstas se han comparado con el Factor Reumatoide, o FR, el cual ha sido tradicionalmente el único marcador de AR de uso rutinario en clínica y que está presente tanto como uno de los Criterios de Clasificación del Colegio Ameri­cano de Reumatología de 1987 para la AR(12) como mar­cador pronóstico.

Sensibilidad

Tiene sensibilidades descritas de entre 70% a 80%.(13) Esta sensibilidad no sobrepasa la del tradicional FR. Aun así, el hecho de buscar anti-CCP en pacientes FR negati­vos se justifica ante la sospecha diagnóstica, ya que hasta un 40% de los pacientes con AR con FR negativos son positivos para anti-CCP.(14)

Especificidad

Como se describió en la introducción, los anti-CCP (CCP2) tienen una alta especificidad para AR. En compa­ración, los valores de especificidad del FR, sin diferenciar por isotipos, si bien varían según el estudio, son conside­rablemente más bajos y no prestan mayor utilidad diag­nóstica.

Se ha demostrado la especificidad del anti-CCP para AR comparando su valor con los valores obtenidos tanto en pacientes con otras enfermedades autoinmunes que cursan con artritis, como en enfermedades no autoinmu­nes que se caracterizan por la presencia de títulos elevados de FR.(13) Éstos son algunos de los casos en que la determi­nación de anti-CCP presta una gran utilidad.

En pacientes con AR de inicio después de los 60 años (EORA, o “Ederly Onset Rheumatoid Arthritis”), el diagnóstico diferencial con Polimialgia Reumática puede ser especialmente difícil. Un trabajo reciente que com­para pacientes con EORA y PMR (con pacientes con AR tradicional y sujetos sanos como controles) mostró una sensibilidad de 61,4% y especificidad de 100%, y valor predictivo negativo y positivo de 69% y 100%, respecti­vamente.(15)

En Artritis Idiopática Juvenil se pueden encontrar anti­cuerpos anti-CCP en porcentajes variables, dependiendo de la técnica usada.(16) Se describen valores de 2%(17) hasta 14%.(18) Cuando están presentes se asocian casi exclusiva­mente al subtipo de poliartritis FR positiva.(16, 19)

En relación a la Artritis Psoriática, la presencia de anti-CCP se ha descrito entre 7,8% (para un valor de corte del anticuerpo 42 U/mL)(20) hasta 15,6%.(21) Su presencia se ha asociado a poliartritis y compromiso erosivo con OR (odds ratio) de 17,99 y 9,8, respectivamente.(20-22)

Aparición temprana

Al igual que la mayoría de los autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes, los anticuerpos anti-CCP apa­recen y son detectables en el suero años antes del inicio de las manifestaciones y diagnóstico de AR. Se ha reportado detección de éstos hasta 18 años antes(24) del diagnóstico de la enfermedad, y en promedio, aproximadamente pre­ceden el desarrollo de enfermedad clínica por cinco años.

En pacientes con artritis de aparición reciente, con cuadros que no permiten un diagnóstico preciso (“artri­tis indiferenciadas precoces”), un 75% de los positivos (CCP2) evoluciona a una AR a un año plazo. Este valor aumenta a 93% a los tres años de seguimiento.(25)

En estudios de donantes de sangre “sanos”, en mues­tras tomadas previo al comienzo de síntomas de AR, la sensibilidad del CCP2 es de 25% en las que precedían el inicio de manifestaciones por más de 1,5 año y de 52% en aquellas de menos de 1,5 año. La especificidad en ambos casos es de 98%.(13)

Capacidad pronóstica

Para la AR existen factores de mal pronóstico, princi­palmente clínicos, y tradicionalmente el FR como marca­dor de laboratorio. Asimismo, el anti-CCP ha demostrado también esta característica, ya que el curso de la enferme­dad en pacientes positivos ha demostrado ser más agre­sivo en términos de actividad y en cuanto al desarrollo de erosiones.(26)

Seguimiento clínico

Queda aún por determinar si estos anticuerpos juegan algún papel en el seguimiento de la enfermedad y res­puesta al tratamiento. En este sentido los hallazgos son poco consistentes, no demostrándose aún una correlación clara entre títulos de anti-CCP y marcadores clásicos de inflamación o respuesta clínica a tratamiento.(27-30)

En un trabajo de nuestro Centro realizado en 2003 con 85 sueros de pacientes chilenos con AR establecida (n = 38), controles sanos (n = 32) y pacientes con enfer­medades del tejido conectivo (n = 47), obtenidos de una seroteca, confirmamos lo descrito en cuanto a sensibili­dad y especificidad. En AR con un promedio de 8,8 años de evolución la sensibilidad del anti-CCP obtenida fue de 90%, con una especificidad de 98,6%, versus 75% y 94% obtenidos, respectivamente, para el FR. Sólo en 4 controles (5,1%) se obtuvieron falsos positivos (2 LES, 1 Esclerodermia limitada, 1 sujeto sano). No se encontró en el grupo estudiado correlación entre HAQ y compro­miso extraarticular con los valores del anti-CCP. (Póster presentado en el Congreso Chileno de Medicina Interna, 2003.)

Discusión

Los anticuerpos antipéptido citrulinado cíclico son anticuerpos de gran valor en el diagnóstico diferencial de pacientes con artritis en los que se sospecha Artritis Reumatoide. Para esta enfermedad los valores de espe­cificidad superan el 95%, y si bien la sensibilidad es de aproximadamente 70%, son un complemento necesario para el tradicional FR.

El hecho de preceder en años el inicio de síntomas o el desarrollo de un cuadro clínico clásico (por ejemplo, al cumplir con los cuatro criterios de clasificación ACR), con valores predictivos positivos altos, permite adelantar el tratamiento en pacientes con artritis indiferenciada y, por ende, obtener una mejor respuesta terapéutica en los destinados a desarrollar AR.

De gran utilidad sería el poder contar con un examen que permita el seguimiento, como otra herramienta además de los tradicionales marcadores de inflamación, así como existen para enfermedades como el Lupus Eritematoso Sistémico (componentes del sistema del complemento y anti-DNA por Farr) y las Vasculitis ANCA positivas (determinación de ANCA por ELISA).

Queda por ver si el hecho de ser anti-CCP positivo es un factor de mal pronóstico tan significativo que even­tualmente justifique el uso de tratamiento con drogas de segunda elección, como anticuerpos anti-TNFa desde un comienzo.

Por lo mencionado, indicaciones para pedir anticuerpos anti-CCP serían: en caso de duda diagnóstica para el diag­nóstico diferencial; en artritis indiferenciadas precoces, y como evaluación pronóstica en AR ya diagnosticada.

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